在之前一篇《癌症治疗领域的明珠—肿瘤免疫治疗》中我们提到，肿瘤免疫治疗是利用人体的免疫机制，通过主动或被动的方法来增强患者的免疫功能，达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤免疫治疗可以分为主动免疫治疗、被动免疫治疗和非特异性免疫调节剂治疗。以肿瘤疫苗为例，利用肿瘤细胞及其来源的相关肿瘤抗原物免疫机体，使机体产生针对该特定肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答，阻止肿瘤的发生发展，该治疗方案包括来自肿瘤抗原的多肽疫苗、树突状细胞疫苗、DNA疫苗以及病毒疫苗等。其中，核酸疫苗便是本文的主角，后续予以重点介绍，下面先介绍下疫苗简史。

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疫苗简史

免疫预防是医学史上最为经济和有效的大众健康手段。在有历史纪录的早期文明中，中国、埃及、印度和希腊等国都有转染病的记载。疫苗接种开始于人痘接种预防天花，在公元10世纪早期印度和中国便开展了人痘接种的实践活动，虽然在接种部位往往会出现较为严重的损伤反应，但是死亡率只有1%-2%，远低于天花自然感染的致死率，因此人痘的接种总体而言是有效的。到了18世纪后叶英国乡村医生EdwardJenner注意到感染牛痘的挤奶场女工不会感染天花这个现象，于年5月14日开展了一次牛痘的接种，证明了其安全性以及免疫的长久性。由于Jenner医生的伟大发现，天花传染病于年被消灭，也是迄今为止人类消灭的惟一的一种传染病。

后续不断有科学家推动疫苗的研究和运用，如近代微生物学奠基人LouisPasteur成功地研制出鸡霍乱疫苗、狂犬病疫苗等多种疫苗。更重要的是，按照巴斯德免疫法的思路，医学科学家们创造了防止若干种危险病的疫苗，成功地避免了斑彦伤寒、小儿麻痹等疾病的威胁。年建立病毒在鸡胚尿囊绒毛膜上的组织培养技术使得抗黄热病和流感疫苗的诞生。乙肝疫苗的研发成功是一个分水岭，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的应用代表作为疫苗的单一蛋白质的纯度水平，是运用重组DNA技术制造的第一个疫苗。随着天花的逐渐消灭和多种传染病疫苗的快速发展，世界卫生组织决定开展免疫接种扩展计划（ExpandedProgramonImmunization，EPI），该计划起初是使全世界每年的新生儿预防包括白喉、百日咳、破伤风、麻疹、脊髓灰质炎和结核等在内的6种疾病，该计划促进了疫苗的使用范围，在相应的疾病预防和控制中发挥了巨大的作用。

图1.EdwardJenner［1］

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疫苗的组成和分类

疫苗的用途是激发机体产生保护性质的免疫反应避免疾病对人体的侵害，但同时又要避免对人体造成真正的感染。一般而言，疫苗成分主要包括抗原（免疫原）和佐剂，前者决定了免疫反应的特异性和保护性，也是疫苗设计环节中最重要的一步。而后者佐剂则起着辅助性作用，能帮助提高抗原的免疫原性和疫苗效果。此外，疫苗的投递系统也与疫苗的效应直接相关，合适的投递系统可以高效地将抗原成分递呈到MHCI类途径或MHCII类途径中从而启动免疫反应。

疫苗总体而言可以分为常规疫苗和生物技术疫苗两大类，常规疫苗包括减毒的活疫苗、灭活疫苗、代谢产物、亚单位疫苗；而生物技术疫苗则包含基因重组亚单位疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗等［2］。表1列出了各类疫苗的一些例子［3］。

表1疫苗的分类

具体而言，减毒活疫苗是将病原体经过甲醛处理后，毒性亚单位的结构改变，毒性减弱，而结合亚单位的活性保持不变，因此该类疫苗效力强劲，作用时间长，但同时也存在潜在的危险性。灭活疫苗采用的是死疫苗，安全性好但是免疫原性变弱，往往需要加强免疫。类毒素疫苗是将细菌所产生的外毒素用甲醛处理以除去其毒性，但仍保留其免疫原性（抗原性），这种除去毒性的外毒素即类毒素，如破伤风类毒素、白喉类毒素。肽疫苗常由化学合成，成分更加简单，DNA重组技术使得能够获取纯抗原分子促进该类疫苗的合成。但随着免疫原分子量和结构复杂性降低，该类疫苗的免疫原性有所降低，需要特殊的结构设计以及特殊的递送系统。基因工程载体疫苗则是利用某些无致病性的或经去除毒力基因后的微生物作为载体，将病毒的保护性抗原基因片段插入到载体微生物基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。这种活载体疫苗具有较强的免疫原性以及亚单位疫苗的准确性两种优势。

核酸疫苗是最近十几年发展起来的一种新型疫苗，核酸免疫也称DNA免疫或基因免疫，分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。核酸疫苗是利用重组DNA技术将保护性抗原基因克隆到真核表达载体，随后将其直接导入体内，使得抗原蛋白经过内源性表达递呈给机体免疫系统，从而诱导机体产生特异性的体液免疫或细胞免疫反应。这种带有特异抗原基因的真核表达质粒称为核酸疫苗（nucleicacidvaccine）或DNA疫苗（DNAvaccine）。核酸疫苗与上述提到的常规疫苗相比有如下优点：（1）核酸疫苗具有与病原体自然感染相似的过程，抗原经内源性合成后转运至细胞表面，可同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，尤其是细胞毒性T细胞淋巴细胞反应。（2）核酸疫苗接种是输入含有特定抗原基因的表达质粒，表达某一种或几种特异性蛋白质，区别于常规的减毒疫苗存在潜在的感染风险。（3）对易变异或存在较多血清型的病原体而言，核酸疫苗可以通过多种质粒的混合物或者构建多种病原体基因的表达质粒来实现多价疫苗。（4）核酸疫苗避免了体外纯化蛋白等繁琐程序，稳定性好，疫苗注射次数和剂量都大大减少。

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核糖核酸（RibonucleicAcid，RNA）存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，RNA是由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成，RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶。在功能方面，RNA和DNA一样，在生命活动中发挥重要作用，它和蛋白质一起承担基因表达和表达调控的功能。RNA与DNA相比小很多，但种类、大小和结构比DNA复杂，与其功能多样化密切相关。

表2动物细胞内主要的RNA种类及功能［4］

生物体内mRNA占细胞RNA总量约2%-5%,丰度最小但是种类最多，其前体结构为不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA），后者经过一系列剪接为成熟的mRNA。mRNA是从DNA转录合成的带有遗传信息的一类单链，往往作为蛋白质合成的模板，决定了核糖体合成肽链的种类。真核生物mRNA一般由5端帽子结构、5端不翻译区、翻译区（编码区）、3端不翻译区和3端多聚腺苷酸尾巴构成，示意图如下［4］。

图2.真核生物mRNA的结构示意图

mRNA疫苗的研究可以追溯到年，来自美国威斯康星大学的JAWolff等人将含有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和半乳糖苷酶基因的RNA和DNA表达载体分别注入小鼠骨骼肌肉内，在所有的病例中都能很容易地检测到蛋白表达（图3），并且不需要特殊的递送系统来达到这些效果。另外，肌注mRNA后60h仍能够表达，具有剂量依赖性。该项研究成果发表于《科学》期刊上［5］。如前述，真核生物的mRNA一般由5’帽子结构、5’非翻译区、开放阅读框（openreadingframe，ORF）、3’非翻译区和1个多聚腺苷酸尾巴Poly（A）等元件组成。mRNA疫苗的合成一般以含有靶蛋白开放阅读框的质粒DNA或其他DNA片段作为模板，通过体外转录技术合成而构成［6］。由于mRNA自身的高度不稳定，后续研究人员通过多种手段来增加其稳定性。例如通过增加一些其他非编码蛋白的区域或其他复合物来增加它的稳定性［7］，以及使用化学修饰的方法合成以提高mRNA的稳定性并降低其免疫原性。KatalinKarikó等人研究了在转录本中加入自然修饰的核苷酸是否会增强mRNA的生物学特性，发现含有假尿嘧啶核苷修饰的mRNA注射小鼠后相对于未修饰的mRNA能显著地增强其转译效率并降低其免疫原性［8］。

图3.肌肉细胞原位细胞化学染色检测大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性

有效的mRNA在体内传递对于实现治疗效果至关重要。外源性mRNA必须穿透脂质膜的屏障才能到达细胞质被翻译成功能蛋白，而mRNA的摄取机制似乎是细胞类型依赖，以及mRNA复合物的理化性质可以深刻地影响其细胞传递和器官分布。迄今为止，mRNA疫苗的递送有两种基本方法。一种办法是将mRNA体外装入树突状细胞（DC），然后再将转染的细胞重新回输［9］；二是直接注射含有或不含载体的mRNA。体外DC加载可以精确操控目标细胞、转染效率和其他细胞条件，但作为细胞治疗的一种形式，该方法是一种昂贵且劳动密集型的疫苗接种方法。而直接注射mRNA相对来说是快速和经济的，虽然在这方面最近有了进展，但它还不能精确和有效地细胞类型特异性递送［10］。这两种方法的各种投递途径总结如下图所示［11］。DC荷载mRNA疫苗往往使用电转的方式来提高转染效率，绝大多数的这种体外荷载的DC疫苗主要诱导机体产生细胞介导的免疫效应，因此主要用来治疗肿瘤疾病［9］。而裸mRNA已被成功地用于体内免疫，尤其是在优先靶向抗原递呈细胞的方式下，如经皮内注射或者淋巴结内注射。值得注意的是，已有研究表明将能够编码肿瘤相关新抗原的未经修饰的裸mRNA重复进行淋巴结内免疫，可以产生强大的T细胞反应和延长无进展生存期（PFS）［12］。具体投递的措施包括基因枪技术、电传输技术、光化学技术等，涉及的投递载体包含脂质、病毒、聚合物、多肽、小分子、金属等，且具备不同的理化性状。也正由于投递系统的不断改良，mRNA疫苗在免疫防治中呈现良好的应用前景［13］。

图4.mRNA疫苗的主要递送方法

研制针对传染性病原体的预防性或治疗性疫苗是控制和预防流行病的最有效手段。然而，传统的疫苗方法在很大程度上未能生产出有效的疫苗来对抗引起慢性或反复感染的具有挑战性的病毒，如HIV-1、单纯疱疹病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）。此外，商业疫苗的开发和批准速度缓慢，不足以应对迅速出现的急性病毒性疾病，正如-年埃博拉病毒和寨卡病毒爆发所表明的那样。与DNA免疫不同，mRNA疫苗仅通过一到两种低剂量免疫就能在动物体内产生有效的中和抗体反应，两种主要类型的RNA疫苗已被用于对抗传染性病原体：自我扩增或复制的mRNA疫苗和非复制性的mRNA疫苗，近期已经有大量的临床前研究报道相关内容，其中有一些研究已经进入人体临床研究试验（表3）［11］。

表3针对传染性疾病的mRNA疫苗临床试验

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除了上述在抗传染疾病方面的应用，mRNA的肿瘤免疫疗法也同样受到越来越多研究者的青睐。树突状细胞是体内专职的抗原递呈细胞（antigen-presentingcell，APCs），而由mRNA修饰过的DC疫苗在抗肿瘤方面的应用正受到广泛探索。此类基于mRNA的DC肿瘤疫苗的作用机制是肿瘤相关抗原mRNA进入DC细胞质后，翻译成相应蛋白质，水解为多肽后经由MHCI类或II类分子途径递呈至细胞表面，拥有相应抗原表位（epitope）T淋巴细胞识别后增殖分化为效应细胞，从而发挥抗肿瘤作用。除了使用mRNA制备肿瘤疫苗，还可以直接使用编码肿瘤特异性T细胞受体和嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor，CAR）的mRNA直接改造T细胞，产生肿瘤特异性效应T细胞。

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（一）Moderna

成立于年的Moderna是一家美国mRNA药物及疫苗研发商，应用于传染病、肿瘤免疫、罕见病和心血管疾病等领域，产品具有引导机体细胞产生细胞内蛋白或分泌蛋白的功能，主要为用户提供预防性疫苗、个性化癌症疫苗mRNA-、瘤内免疫肿瘤mRNA治疗剂等产品。

Moderna公司年与阿斯利康签订2.4亿美元的技术合作之后，又与AlexionPharmaceuticals（亚力兄制药）、默克等制药公司签订技术合作，获得近20亿美元资金用于技术开发与临床研究。该公司有四个不同研究方向：感染性疾病、肿瘤免疫治疗、个体化肿瘤疫苗及罕见病，且均以mRNA技术平台作为药物开发的基础，公司共有10项新药进入临床期研究［14］。

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